蔡元培字鹤卿（后改字仲申），别名鹤遥号孑民。1868年1月11日（清同治六年十二月十七日）出生于浙江绍兴的一个商人家庭。祖父蔡廷桢，曾任当地一家典当铺经理。父亲蔡光普，当过钱庄经理。
六岁那年，蔡元培开始跟随家庭塾师读书识字。十四岁起受业于同县秀才王懋修，受其影响，蔡元培很讲究孝道，并一度崇拜宋儒。1883年，他十七岁时考中秀才。此后他在家乡设馆教书，当了两年塾师。二十岁时，他应邀到同乡徐树兰家为其校订所刻图书。徐氏藏书丰富，蔡元培且工且读，博览群书，学问因之大进。1889年，蔡元培参加浙江乡试，得中举人。第二年赴京会试，考中贡士。1892年参加殿试，被录为第二甲第三十四名进士，不久被点为翰林院庶吉士。光绪帝的老师翁同烦圃匏“年少通经，文极古藻，隽材也”。1894年，蔡元培由庶吉士升补翰林院编修。这时，他虽年仅二十多岁，却已成为士大夫中的一颗耀眼新星，为朝野争相结纳，名噪一方了。
十九世纪末期，清王朝已是日趋衰落。蔡元培科举连连奏捷、平步青云之时，也正是清廷危机四伏、摇摇欲坠之际。1894年甲午战败，丧权辱国的《马关条约》签订，举国为之震动。身为翰林编修的蔡元培也深受刺激，他悲愤地写道：“上决与倭议和，和约十事，其大者，割台湾，割奉天辽阳以东，遵海而南至旅，给兵费二万万，定七年毕给。倭人驻兵威海，岁给兵费五十万。俟二巨万毕给，乃退兵，皆允之矣。日蹙百年，且伏祸机。韩、魏于秦，宋于金，不如是之甚也！”“圣上谦抑，博访廷议，而疆臣跋扈，政府淙祝外内狼狈，虚疑恫澹以成炀灶之计，聚铁铸错，一至于此，可为痛哭流涕长太息者也①①引自蔡元培《杂记》手稿，见周天度著的《蔡元培传》第6—7页，人民出版社1984年出版。！”爱国之情，跃然纸上。他开始感到要寻求国家和个人的出路，必须变祖宗之法。这时，他接触了西学，对西方的资产阶级民主思想表现出浓厚的兴趣。他同情戊戌变法，对献身变法的激进的谭嗣同尤为敬佩。
蔡元培最初是赞同改良的，他认为通过自上而下的改革可以使中国臻于富强，戊戌变法的失败是因为未能先培养革新人才，民智未开之故。因此，他于1898年10月毅然辞官归里，投身于教育事业。这以后，他逐渐抛弃了改良主义思想，从一个晚清翰林、清朝统治集团的一员，反戈一击，转化为一个反清的资产阶级革命家。
1901年，蔡元培到上海任南洋公学特班总教习。1902年，他发起成立了中国教育会，因他“表面办理教育，暗中鼓吹革命”而被推为会长。此后，蔡元培相继创办了爱国女校和爱国学社。这两所学校以宣传爱国和革命为目的，正如蔡元培后来所说：“盖当时一般志士，鉴于满清政治之不良，国势日蹙，有如人之罹重病，恐其淹久而至于不可救药，必觅良方以治之，故群起而谋革命。革命者，即治病之方药也。上海之革命团，名曰中国教育会。革命精神所在，无论其为男为女，均应提倡，而以教育为根本。故女校有爱国女学，男校有爱国学社①①引自蔡元培的《在爱国女学校之演说》，见周天度著的《蔡元培传》第13页，人民出版社1984年出版。”在他的主持下，这两所学校成为革命的大营，影响波及全国，震撼了清朝的反动统治。
受俄国虚无党的影响，蔡元培曾一度热衷于暗杀活动。1904年，东京留日学生军国民教育会秘密成立了暗杀团。蔡元培知道有这个组织后便要求参加。他认为革命只有暴动和暗杀两个途径。为此，他在爱国学社中竭力助成军事训练，“算是下暴动的种子”；而女子更宜进行暗杀，故特别重视理化课讲授，以便将来练制炸弹，“预备下暗杀的种子”。他自己也秘密租赁房屋，试制炸弹，试图用暗杀清吏的手段进行革命。
随着革命形势的发展，蔡元培与龚宝铨等于1904年冬在上海建立了反清的革命组织光复会，他被推为会长。光复会的成立，对东南地区的革命斗争起到了重要的推动作用，并与孙中山创立的兴中会、黄兴创立的华兴会形成鼎足之势。1905年8月，中国同盟会在东京成立时，光复会就成为同盟会的一个重要组成部分，蔡元培也被任命为同盟会上海分会的会长。后来，他感到在上海“所图皆不成，意颇倦”，而于1907年赴德留学，直到1911年武昌起义后才回到祖国。
1911年12月1日，蔡元培回到上海。这时，中华民国南京临时政府正在组建之中。他作为同盟会的代表之一，同时也由于他在教育界的地位，在新诞生的临时政府中担任了教育总长。
在蔡元培的具体领导下，南京临时政府教育部于1912年1月颁布了《普通教育暂行办法》，对清末的旧学制进行了改革，其主要内容是：改学堂为学校；小学废止读经；各种教科书须符合共和国国民宗旨，清学部颁行的教科书一律禁用；初等小学可以男女同校；中学为普通教育，取消文实（指理、工、农、医诸科）分科之制；废止旧时奖励出身等。他极力提倡社会教育，在拟订教育部官制时，创设了社会教育司，使社会教育第一次在教育行政上获得了独立的地位。
南京临时政府成立之时，正是百废待兴之际。蔡元培就任教育总长后问孙中山，教育部在哪里办公？孙中山说：“这要你自己去找。”于是蔡元培在南京“踯躅里巷”，四处寻找房屋。后向江苏督署内务司司长马相伯商借了三间房作为教育部的办公室。他主张办理部务要精兵简政，因事择人，不必多设冗员。教育部初设时，连他在内只有三人，后来机构渐趋完备时也不过三十余人。在他的主持下，教育部工作效率极高，大家分工作事，如有案牍，随到随办，小学、中学、大学各项学制，部员各就所学，担任起草之职。他为人廉正，生活俭朴，能以平等态度待人。教育部上自总长下至部员，不分等级，每月一律给三十元，每月开支不过千元。蔡元培以自己的实际行动，赢得了人们对他的崇敬。
1912年2月，孙中山辞去临时大总统职，推荐袁世凯继任。为了牵制袁世凯，孙中山向参议院提出了三项条件：（一）临时政府地点设于南京；（二）新总统须亲到南京受任；（三）新总统必须遵守《临时约法》及所颁布之一切法律章程。18日，孙中山派蔡元培为迎接袁世凯南下的专使前往北京。袁世凯不愿意离开自己的老巢北京。他一面极力敷衍迷惑蔡元培率领的专使团，表示愿即时南行，一面指使亲信纵兵哗变，以示若袁世凯南行将引发北方兵变。蔡元培受其欺骗，于3月13日发表文告，说明赴北京经过及不得不同意袁世凯在北京就职的原因。袁世凯如愿以偿地在北京宣誓就任临时大总统。
袁世凯当上临时大总统后，邀请蔡元培继续担任教育总长。他力辞未果，于4月26日，正式到北京教育部视事。7月，他因不满袁世凯擅权，与同盟会阁员王宠惠、宋教仁等一起辞职。
蔡元培任教育总长期间，对全国教育进行了一些改革，主要是采用西方资本主义国家的教育方针和教育制度，代替清朝封建主义的教育方针和教育制度。他提出停止祀孔，废除读经，把清学部规定的忠君、尊孔、尚公、尚武、尚实五项封建主义的教育宗旨，改为资本主义的军国民教育、实利主义、公民道德、世界观、美育五项。他解释说：军国民教育、实利主义，“所谓富国强兵之主义也。”公民道德，“所标揭者，曰自由、平等、博爱”。世界观教育，“就是哲学的课程，意在兼采周秦诸子，印度哲学，以及欧洲哲学，以打破两千年墨守孔学的旧习”。“提出美育，因为美感是普遍性，可以破人我彼此的偏见；美学是超越性，可以破生死利害的顾忌，在教育上应特别注重①①引自李新、孙思白主编的《民国人物传》第1卷第330页，中华书局1978年出版。”用这种资产阶级教育宗旨为指导，他主持了学制改革，课程修订，推行义务教育和社会教育等等。这些不彻底的改革，反映了资产阶级一定程度的反封建的要求。
蔡元培辞去教育总长后，于1912年7月赴德国莱比锡大学听讲，并在世界文明史研究所从事研究工作。1913年初，国内发生了刺杀宋教仁的大血案。6月，蔡元培应孙中山之召，从欧洲返抵上海。他抱着书生之见，企图调和袁世凯和南方国民党之间的冲突。7月，“二次革命”爆发，他毫不迟疑地支持反袁，发表了《敬告全国同胞》一文，指出反袁战争为“正当战争，为保护吾侪安全幸福之间接作用，则吾侪不特不肯反对，且相率为助成之”，主张劝告袁世凯退位，以期能避免战争，和平解决南北争端。“二次革命”失败后，蔡元培决定再赴欧洲研究学术。是年10月，他到达法国，在那里从事著述，曾著有《哲学大纲》、《石头记索隐》等。在此期间，他还与李石曾、吴玉章等人组织勤工俭学会、华法教育会，提倡留法勤工俭学。
1916年6月，袁世凯恚恨而死，黎元洪继任总统。这年冬，蔡元培被任命为北京大学校长。他随即离开法国，于1917年1月4日正式到校就职。
北京大学的前身是京师大学堂，创办于1898年。在清末十几年中，该校所收学生多为京官，他们读书志不在求学，而在于猎取功名利禄，因此官僚习气很重。民国以后也无多大改变，校风非常腐败。蔡元培到任后，决心整顿革新北大。他到校后第一次演讲就号召学生不要追求升官发财，要以研究学术为天职，勉励学生们“抱定宗旨”、“砥励德行”、“敬爱师友”。
为了转变学校的风气，引导学生对读书和研究学问发生兴趣，蔡元培大力吸收进步学者，充实了教员阵容。他到任不足十天，就聘请了新文化运动的倡导者陈独秀任北大文科学长（即文学院长）。继陈独秀之后，蔡元培又聘请了李大钊、胡适、钱玄同、刘半农、周作人等人，并委以重任，如李大钊任图书馆主任，胡适任文科教授兼哲学研究所主任等等。在整顿和改革北大的过程中，蔡元培提出了著名的“思想自由、兼容并包”的办学方针。他提倡学术研究自由，主张无论何种学派，只要“言之成理，持之有故”，就应该让它们并存，听其自由发展；对于教员，无分新旧，即使政治见解和政治倾向各异，也让他们并存，任由学生选择。这样，北大各派学者在学术上各抒己见，百家争鸣，使学校学术空气空前活跃，开创了一代学术自由思想自由的新风。