哥伦布再次远航的消息像长了翅膀传遍西班牙。为新大陆的财富所吸引，自愿参加者蜂拥而至，达官贵人也倾囊相助。不足5个月，一支由17艘各种型号的帆船和1500余人的远征探险队组成了。1493年9月25日，这支庞大的船队，载着大批马、牛、猪、驴、高大的猎犬及许多农作物的种子，浩浩荡荡驶离加的斯港口，开始了第二次远航。
为了更早地到达海地岛南面那个生产更多黄金的岛屿，哥伦布选取了一条更加偏南的航线，然后向西横渡大西洋，借强劲的东风，这次出乎意料地只用10天就横渡了大西洋。以后，这条无意的捷径就成为欧洲前往西印度常走的路线。
11月3日，船队驶进一座绿树成荫的美丽岛屿，由于是星期天，哥伦布便将该岛命名为“多米尼加”，接着又发现了其他的岛屿，因无人居住便很快离开了。之后，他们发现了一片由40多个小岛组成的陆地，哥伦布形象地把它叫做1100个姑娘群岛，即“维尔京群岛”。这些岛屿千姿百态，但多为不毛之地。
11月27日，船队顺利地抵达纳维达德城堡附近海湾。哥伦布下令放了两炮，以便和岸上联系，结果毫无反应。哥伦布亲自登岸后，发现寨堡已荡然无存，那39位留守的西班牙人也早已不见踪影。原来，这些留守人员对岛上居民横加歧视，无所不为，遭到强烈反抗，结果，西班牙人无一幸免于死。
这一惨状激怒了哥伦布，他下决心进行报复，便在一个易于防守的地方重建殖民据点，取名“伊萨白拉”，以示对女王的纪念。他又派一部分人到内地寻找黄金，很快，就有人报告说找到了丰富的金矿，还带来了金沙样品。由于这里湿热的气候使食物迅速霉烂，药品短缺，疫病盛行。于是，哥伦布决定只留下5艘船和500人，其他的船只和人员先期回国，并向国王报告此次远航的结果。
大批人员回国后，哥伦布留下一支强大的守备军，由他弟弟迪雅哥指挥驻守伊萨白拉城，同时，派一部分人去开采黄金，自己率3只快帆继续西航，前往他心目中的“印度”——古巴岛。他在古巴南岸进行探测，确认古巴最东部的海角是亚洲大陆的一部分。而且在古巴以西发现了不少岛屿，3只快帆在这个星罗密布的岛屿迷宫里穿梭前进，克服重重困难，充分显示了哥伦布作为一个航海家的杰出才能。由于船只漏水，只好返回伊萨白拉城。
由于软弱无能的迪雅哥无法控制局势，伊萨白拉处于一片混乱的情形。哥伦布回岛后，恼羞成怒，开始了全面征服岛上居民的血腥屠杀的远征。不幸的印第安人难以抵挡最新式武器的进攻，惨遭杀害，幸存者沦为奴隶。他们世代积攒的黄金被榨取一空。