书城医学药理学基础学习精要
15354900000017

第17章 细胞和分子基础(5)

DNA连接酶不但在复制中起最后缝合缺口作用,在DNA修复、重组、剪接过程中也起缝合缺口的作用,在基因工程中,它作为重要的工具酶之一使用。

DNA复制发生在细胞周期的S期(DNA合成期)。细胞进入分裂期后,复制好的两个DNA分子分别参与形成染色体的两个单体。细胞分裂后期,每条染色体的两条染色单体各被纺锤丝牵拉,分别向细胞两极移动,随着胞体的分裂,复制好的两个DNA分子伴随着各自的染色单体进入两个子细胞。这样,遗传信息从亲代传给了子代细胞,保证了遗传物质数量的恒定性。

(三)基因的表达

基因表达是指生命过程中,储存在基因中的遗传信息,通过转录和翻译,转变成蛋白质或酶分子,形成生物特定性状的过程。

1.转录

以DNA为模板,在RNA聚合酶作用下合成RNA的过程称为转录。真核生物及人类的转录过程在细胞核中进行。

(1)转录过程转录过程就是DNA分子上的遗传信息传递到RNA的过程。转录时,细胞核中DNA分子的局部双链在酶的作用下暂时解旋,以其中一条DNA链(如3’→5’)作为RNA合成的模板链,按碱基互补配对原则(RNA中以U代T,和DNA的A配对),以四种三磷酸核苷酸(ATP、GTP、CTP、UTP)为原料,在RNA聚合酶的催化下(沿DNA3’→5’滑动)合成出一条单链的RNA,RNA合成方向为5’→3’。

转录终产物RNA包括mRNA、tRNA、rRNA,分别称为信使RNA、转移RNA和核糖体RNA。mRNA可进一步翻译出蛋白质。

(2)转录产物的加工和修饰新转录出的mRNA还须经过一系列加工、修饰过程才能变得成熟,具备正常功能。

(3)反向转录或逆转录大多数生物的基因是双链DNA。少数低等生物,如一些病毒称为RNA病毒,其遗传信息贮存在单链RNA上。1970年,Temin和Baltimore分别发现这类病毒的复制分两步进行。

第一步:以RNA为模板合成RNA-DNA杂化双链,催化这一步的酶叫反转录酶,从功能上更准确地称之为依赖RNA的DNA聚合酶。

第二步:以新合成的DNA链为模板,合成DNA双链。合成的DNA也可再作模板,生成RNA,原有的RNA链可被核糖核酸酶H(RNAaseH)水解。

这一重大发现的意义在于揭示了复制不单以DNA为唯一模板,遗传信息不一定都从DNA流向RNA。RNA也可作模板,使DNA从RNA中得到遗传信息。这是一种复制的特殊形式,过程和DNA→DNA复制一样,也是从5’→3’延长,只不过模板不同,碱基配对也和复制相似,只不过用U代替了T。试管内加入RNA模板(包括从高等动物组织提取的RNA),在有反转录酶和原料dNTP存在下,也可合成DNA,这种DNA称为cDNA,即互补性DNA。

2.翻译

在mRNA指导下的蛋白质生物合成称为翻译。翻译过程实际上就是把DNA转录到mRNA的异常信息“解读”为多肽链上的氨基酸种类和顺序的过程。翻译过程十分复杂,需要mRNA、tRNA、rRNA、核糖体、有关酶以及蛋白质辅助因子的共同作用,还需要各种活化的氨基酸作为原料,并依赖ATP、GTP提供能量。整个过程在细胞质中进行,可分成以下几个步骤。

(1)氨基酰-tRNA的形成氨基酸在氨基酰-tRNA合成酶和ATP的作用下被激活,并与相应的tRNA结合成氨基酰-tRNA复合物。

(2)肽链合成起始在起始因子(IF)作用下,核糖体的小亚基结合到mRNA的起始密码子AUG上。同时,具有起始作用的蛋氨酰-tRNA(原核生物为甲酰蛋氨酰-tRNA)通过tRNA的反密码子UAC配对结合上去,然后,核糖体大亚基与小亚基结合成起始复合物。

(3)肽链的延长核糖体有两个氨基酰-tRNA的结合位点——P位(肽位)和A位(氨酰基位)。起始的蛋氨酸-tRNA结合在P位,随后,根据A位上的密码子,带有相应反密码子的氨基酰-tRNA能正确进入A位。在转肽酶催化下,P位上的氨基酰基结合到A位的氨基酰-tRNA上,形成二肽酰-tRNA。

(4)肽链的终止核糖体沿mRNA由5’端向3’端不断移动,当A位出现终止密码时(UAA、UAG或UGA)时,不再有任何氨基酰-tRNA进入A位,此时释放因子(RF)结合上去并发挥作用,使肽酰-tRNA酯键断裂,核糖体释放出多肽和tRNA,并与mRNA分离,进一步解离成两个亚基,肽链合成完毕。

转录和翻译是基因中的遗传信息表现为特定性状的两个功能过程。它们紧密联系,转录在细胞核中进行,翻译在细胞质中进行。

五、基因重组和基因工程

基因有相当的保守性,亲代性状可传给子代。但是,也并非一成不变。DNA分子中可能发生某一核苷酸的缺失、置换,引起移码突变等。此外,尚可发生基因交换。有的交换在同一染色体中,有的在两个染色体之间进行。甚至一个生物体的基因可以插入另一个生物体的染色体中,并在宿主体内进行复制、转录及翻译,这就是基因重组。由此可见,基因重组是生物界固有的现象,且有很重要的意义,如物种进化、两性繁殖、病毒感染等过程中均存在天然的基因重组。

基因工程是指在试管内应用人工方法进行基因重组,把重组的基因导入细胞或细菌,进行复制、转录及翻译。利用这一技术,可以扩增DNA,生成蛋白质,或是创造生物新品种;也是研究基因表达及表达调控等理论课题的重要方法。因此,基因重组及基因工程,成为生物化学与分子生物学研究的热点。

(一)基因重组

基因重组有多种形式,如转化、转导及转位等。

由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。例如致癌病毒上存在一些特殊碱基序列,称为癌基因。致癌病毒感染宿主细胞以后,癌基因随病毒基因而整合到宿主细胞的染色体中,癌基因可被转录,并翻译成蛋白质,这些特殊蛋白质能使正常宿主细胞转变为癌细胞。常用的宿主细胞为3T3纤维母细胞。把癌基因导入细胞后,重组入宿主细胞的染色体DNA中。正常的3T3纤维母细胞转化为具有恶性肿瘤行为的癌细胞,转化细胞能在琼脂中生长繁殖,能在无胸腺鼠中长成肿块,而正常细胞不能。

当噬菌体(或病毒)DNA整合进入宿主染色体中后,在利用宿主的代谢体系而进行复制时,有可能使邻近噬菌体DNA的宿主细菌基因一起被复制,成为病毒DNA的一部分,并一起组装入病毒内。当子代病毒再感染其他宿主病毒时,这段宿主来源的基因,称为转导基因,它可以像噬菌体DNA一样,一起重组入宿主的染色体中。

转位是指一个或一组基因从一处转位到基因组的另一个位置,这些游动的基因称为转位子。免疫球蛋白的生成就是通过基因转位和重组而产生的过程。

(二)基因工程

基因工程是按人的意愿用分离纯化或人工合成的DNA(目的基因)在体外与载体DNA(质粒、噬菌体等)结合,成为重组DNA,以此去转化宿主(细菌或其他细胞),筛选出能表达重组DNA的活细胞(称转化子),并将其加以纯化、传代、扩增,成为克隆,以此获得大量相同的DNA分子。因此,基因工程也称为基因克隆。

所谓克隆就是同一副本或拷贝的集合,相当于无性繁殖系;获取同一拷贝的过程称克隆化。从大量群体细胞中分离出单一细胞类型,这样产生的很多相同细胞称为克隆细胞。例如从由免疫小鼠脾细胞(能产生抗体)和骨髓瘤细胞(能在体外无限制繁殖)融合成的杂交瘤细胞群体,分离筛选出分泌某一特异性抗体称为单克隆抗体。同样,从众多不同的分子群体中分离到很多相同分子即分子克隆。现代生物技术所谈的分子克隆是指DNA(分子)克隆。

基因工程的基本过程可概括为分、切、接、转、筛5个阶段。

1.分——载体和目的基因的分离

(1)载体常用的有质粒、γ噬菌体、M13噬菌体等。

质粒是环形双链DNA,大小约为数千个碱基对,存在于大多数细菌的胞质中。每个细菌能容纳的质粒数目称为拷贝数。拷贝数越大,当然对基因工程的生产应用越有利。质粒易于从一个细菌转移入另一个细菌。质粒上往往带有一个或两三个抗药性基因,这就有利于应用它的抗药性进行下一步的筛选工作。理想的质粒,对同一种限制性内切酶只有一个切口。

质粒和噬菌体在与其宿主菌共同培养中可大量产生,但它们的DNA与细菌DNA在大小、密度、碱基组成上都有差别。因此经过破碎细菌、密度梯度离心等方法,可以获得纯化的载体DNA。

(2)目的基因可直接从染色体DNA中分离,可人工合成,也可以从mRNA合成cDNA而产生。第四种方法是组建“基因文库”,即把染色体总DNA用一种限制性内切酶随机切割成数以万计的片段,然后重组到载体中,得到数以万计的混杂质粒。然后用探针技术把目的基因“钓”取出来。

2.切——限制性内切酶的应用

限制性内切酶犹如基因工程的手术刀,它能识别核酸分子某些碱基序列并加以切开。限制性内切酶切过的DNA,有两种不同类型的切口。一种称平端切口,即在同一水平上切断DNA的两股链;另一种为粘端切口,即两链的切口错开2~4个核苷酸。

3.接——把载体和目的基因接合成体外重组体

用同一种限制性内切酶切割载体及目的基因后,无论产生的是平端切口或粘端切口,都可以用DNA连接酶把载体和目的基因连接起来。

4.转——重组体的转化

重组载体如系大肠杆菌质粒,则可在0~4℃用CaCl2处理大肠杆菌,以增大其细胞膜的通透性,然后将CaCl2处理过的细菌与重组质粒进行短暂温育,使质粒透入菌体。将DNA片段导入宿主细胞以改变其某些性状,进行转化。

重组载体如系噬菌体DNA,可进行体外包装,将其包以γ噬菌体的外壳蛋白(头部),并使其含有尾部蛋白,成为有侵染力的噬菌体,以导入宿主细胞。亦可用CaCl2处理宿主细胞,将重组DNA直接引入细胞。以噬菌体DNA导入细菌引起的转化称为转染。

进行转化和转染宜选用不含限制性内切酶的突变菌株作为宿主,以减少外源性DNA被破坏清除的可能性。

5.筛——DNA重组载体筛选与鉴定

将重组载体引入宿主细胞,并将其初步扩增后,应加以筛选,以便筛出含目的基因的菌株,并鉴定之。确定克隆株后,即可繁殖菌株进行进一步的扩增。

根据重组载体的表型进行筛选是常用方法之一。可以利用载体质粒对抗生素的抗药性进行筛选。如质粒pBR322,由4362个核苷酸对构成,对四环素及氨苄青霉素均有耐药性。将此质粒导入对上述两种抗生素无耐药性的细菌后,则此细菌变成有耐药性了。这样宿主菌是否已转化,可在培养基中加入上述抗生素予以筛选;未转化的细菌被杀死,已转化的则生成菌落。

此外,也可以利用对营养素的依赖表型来筛选。例如,目的基因是亮氨酸自养型(leu+),可把重组体转化于亮氨酸异养型(leu)的宿主中,放在不含亮氨酸的培养液中培养。能长出菌落的,表示重组体已含目的基因,即用重组体leu+补足了宿主的leu-。而不含目的基因的质粒,却不能使leu-的宿主生长。

总之,基因重组技术发展十分迅速,具有产业化能力的基因工程正在各生物领域快速发展。基因工程可从分子水平改良现有的生物品种(如大肠杆菌),它将给生化药物、食品、轻工、化工等工业赋予新的生命力。此外,基因工程在疾病基因的发现、基因诊断(遗传病诊断)、基因治疗(利用基因工程向有基因缺陷的细胞补充相应功能的基因)和遗传病预防等方面都有广泛的应用价值。

脂类代谢

脂类是脂肪及类脂的总称。脂肪是三脂肪酸甘油酯,称三酰甘油也称甘油三酯。类脂包括固醇及其酯,磷脂及糖脂等。它们是一类不溶于水而易溶于有机溶剂,并能为机体利用的有机化合物。

一、脂类的化学

(一)脂肪

脂肪是1分子甘油与3分子高级脂肪酸所形成的酯,故称三酰甘油,又称真脂或中性脂肪,其结构如下:

R1、R2、R3代表脂肪酸的羟基。若3个脂肪酸都相同,称为简单三酰甘油,如三硬脂酰甘油、三油酰甘油等。若含有两个或3个不同的脂肪酸则称为混合三酰甘油。自然界的脂肪中,多数是混合三酰甘油的混合物,简单三酰甘油较少,仅橄榄油和猪油含三油酰甘油高达70%。

(二)类脂

类脂是性质与脂肪类似的物质。主要有磷脂、糖脂及固醇类等。

1.磷脂类磷脂有磷酸甘油酯和神经磷脂等。磷酸甘油酯主要有磷脂酰胆碱、磷脂酰胆胺、磷脂酰丝氨酸、双磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇等。

磷酸甘油酯是磷脂酸的衍生物。甘油中的两个羟基和脂肪酸结合成酯,第三羟基被磷酸酯化生成磷脂酸。磷脂酸再与其他醇羟基化合物连接,即组成不同的磷脂。

磷酸甘油酯分子中,两个长脂肪酸链为非极性,其余部分为极性,所以磷脂是两性脂类。它是生物膜的主要成分,在脂类的消化吸收及脂类的运输等方面起着非常重要的作用。